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医学论文

C6胶质瘤细胞的侵袭、迁移和增殖

时间:2023-03-28 00:03 所属分类:医学论文 点击次数:

1.方法
(1)将C6细胞分为Q0、Q50、Q100和Q1504组,Q0组加适量二甲亚砜(DMSO,即槲皮素溶剂,每2mlDMEM全培养基中加入1mlDMEMμ低浓度DMSO对细胞生长无影响)处理,Q500、Q100和Q150的槲皮素浓度分别为500、100、150μmol/L。然后将其放入37℃、在5%的CO2孵化器中进行培养。
(2)将三维细胞培养基质胶Matrigel放入冰箱或冰箱2~8℃过夜解冻,吸管轻轻吹打,避免吸入气泡。用高糖DMEM做1∶5稀释后的Matrigel应用于Insert细胞生长面,150~200μl/cm2,37℃作用30min,备用。将饥饿12~24小时后,C6细胞制备细胞悬液、离心弃培养液、PBS洗1~2遍,用含0.1%FBSDMEM配养基重悬细胞,将细胞密度调至5%×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室,取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%CO2培养36小时后,用棉签擦去Matrigel和上室内细胞,甲醛固定10分钟。0.1%结晶紫室温下孵化10min,用清水冲洗3次以上。将Transwell小室翻过来,底面朝上,在显微镜下观察拍照,随机选取8个~10个视野进行计数。
(3)将饥饿12~24小时后,C6细胞制备细胞悬液、离心弃培养液、PBS洗1~2遍,用含0.1%FBSDMEM配养基重悬细胞,将细胞密度调至5%×105个/厘米2。取2000个。μl细胞悬液加入Transwell上室,取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μ加入下室。37℃、5%CO2培养36小时后,用棉签擦去室内细胞,甲醛固定10分钟。0.1%结晶紫室温孵化10min,用清水冲洗3次以上。将Transwell小房翻过来,底面朝上,在显微镜下观察拍照,随机选择8个~10个视野进行计数。
(4)将培养好的C6胶质瘤细胞培养基半量换液,加入1ml含20μmolLEDU全培养基的最终工作浓度为10μmol/L。在37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时后,放弃培养液,加入1ml3.7%甲醛在室温下固定15min,放弃固定液,用3%BSA洗两次。然后加入1ml00.5%TritonX-100室温下孵化20分钟;放弃透明液,用3%BSA洗两次。然后加0。.5mlClick-it反应混合物,室温下避光振荡30min。放弃反应液,用3%BSA洗一次。然后加入1ml1×Hoechst3342反应液室温下避光反应30min。用PBS清洗两次后,在激光共聚焦显微镜下拍照分析,计算其增殖细胞百分比。
(5)室温下收集的悬浮细胞400g离心5min。放弃上清,加入2500g。μL胰酶溶液(A液),用手指轻轻弹合,室温下反应10min。然后加入2000种。μl胰酶抑制剂与核糖核酸酶混合物(B液)用手指轻轻弹合,室温下反应10min。最后加入200μl冷PI染液(C液)用手指轻轻弹合,4℃避光反应10min。然后在3小时内检测到上流细胞仪。
2.统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示使用SPSS13.方差齐性检验和单因素方差分析(One-WayANOVA),P<0.05是差异,具有统计意义。
3结果
1.槲皮素处理36小时后,Q50、Q100和Q150组的侵袭细胞比例分别为(450.81±7.55)%、(13.63±3.15)%和(4.63±1.12%,与对照组(100%)相比,槲皮素处理组的入侵细胞比率显著降低(P均)<0.01)槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的入侵能力,并具有一定的浓度依赖性。与对照组(100%)相比,槲皮素处理12小时后Q50、Q100和Q150的迁移细胞比分别为570.98%±6.84%、33.60%±3.91%和11.79%±3.27%(P均<0.槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的迁移能力,并具有一定的浓度依赖性。
2.槲皮素处理24小时后,Q50、Q100和Q150组的增殖细胞百分比分别为211.49%、7.30%和1.与对照组(45%).与37%相比,其增殖细胞百分比显著降低(P<0.01),并表现出一定的浓度依赖性。
4.讨论
研究发现,槲皮素(处理时间为24小时)通过抑制核苷酸类似物Edu与其细胞核混合来抑制C6胶质瘤细胞的增殖,并将其阻断在S期。上述研究证实,槲皮素可以显著抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖,但阻断其细胞周期的环节存在差异,这可能与操作时的处理时间和细胞生长密切相关;早期研究发现,槲皮素可以阻断G0/G1、S或G2/M的癌细胞;槲皮素阻断细胞在S期或G2/M期依赖于细胞的类型和处理程度。本研究对胶质瘤侵袭和转移的临床研究具有一定的指导意义。综上所述,槲皮素能抑制体外C6胶质瘤细胞的侵袭、迁移和增殖,但其作用机制和临床治疗的应用仍需进一步研究。